共聚焦显微镜

介绍

激光扫描共聚焦显微镜(LSCM,或共聚焦)是一种特殊类型的光学显微镜。激光束扫描样品以形成图像,图像以数字文件的形式存储在计算机上。与传统的“宽视场”光学显微镜相比,共聚焦显微镜的关键优势在于它只能成像样本的一个狭窄切片,换句话说,它有一个狭窄的视场深度(小到0.4毫米)。只检测到来自焦点平面的信息。这使得操作者可以从样品深处获取单个图像(或光学部分)。还可以指示共焦从多个离散的聚焦级别获得一系列图像。所得到的数据集允许研究者以三维的方式查看他们的样本,并在这三维中操作和测量结构。

除了狭窄的景深之外,共聚焦还有其他几个优点。在最佳条件下,LSCM可以分解比传统光学显微镜(〜100nm)更小的细节。图像的集合快速,可以在保存之前预览。共聚焦成像还避免了与摄影成像相关的困难,例如开发和印刷延迟和化学废物产生。

共聚焦显微镜通常以EPI-荧光模式操作,尽管它也可以用于反射和透射光模式。Most confocals are equipped with one or more lasers that can excite most common fluorescent probes excited by visible light (e.g. FTIC, Rhodamines, Cyanine dyes.) UV lasers are available (to excite probes such as DAPI or Fura-2) but are quite expensive and have safety and phototoxicity issues. Visible light excited fluorescent dye analogs are available for most UV dye applications. Sample preparation is identical to that for conventional epi-fluorescence with heavier staining sometimes being an advantage. Thick and thin, living and fixed biological specimens, as well as materials samples can be examined. The reflected mode is used to image surfaces or reflective stains within samples. Samples of this type include geological materials, semi-conductors, optical storage disks and tissues or cells labeled with colloidal gold or silver stains. The transmitted mode functions the same as that of a conventional light microscope with samples able to be viewed by bright field, darkfield, phase contrast or differential interference contrast. Some confocal manufacturers support full color transmitted light imaging.

这些模式中的所有三种都是计算机控制的,并利用了共聚焦计算机的数字图像处理能力。图像可以在带有标签,箭头,刻度条和测量的屏幕上注释。可以在彩色激光或染料 - 升华打印机或35mm薄膜上印刷图像。文件可以在Zip,Jaz,CD-R或CD-RW磁盘上归档,也可以通过Internet传输到其他计算机。

理论

在共聚焦显微镜中,样品中的荧光标记是用激光而不是水银或氙灯激发的(就像在传统的外显荧光显微镜中那样)。激光束聚焦到一个点上,扫描整个样品,一点一点,一行一行。在扫描的每个点,发射的荧光被物镜收集,通过一个光圈,然后被光电倍增管(PMT)检测。一个适当亮度的像素被存储在内存中并显示在显示器上。一个典型的图像由一个512 × 512像素的数组组成,给出的图像大小为256k字节。共焦效应的关键是针孔,也就是虹膜。这个可调节的光圈可以防止非聚焦光被PMT检测到,从而使系统只成像样本的一个薄片,即“光学部分”。关闭虹膜可以得到更薄的“光学切片”和更好的分辨率,而打开虹膜可以得到更厚的切片和更亮的图像。

共聚焦设计

大多数现代共聚焦显微镜遵循两种设计之一;“激光点扫描”或“旋转盘”。在激光光斑扫描系统中,一个或两个振镜控制的镜子扫描通过样品的聚焦光斑。从每个点发出的荧光通过针孔(如果是从焦点平面),并被PMT检测。根据分辨率设置(可以是2048 * 2048像素或更高),扫描时间可以从几分之一秒到几分钟不等。多达5种不同的荧光探针可以检测一次。这是最常见的共焦类型,也是最有效的。它产生最高分辨率的图像,是最灵活的成像模式。

旋转盘共聚焦采用一个或两个具有规则间隔孔的旋转盘。当光(来自水银灯或激光)被投射到圆盘上时,孔沿着照亮光的同心弧线穿过样品。当荧光或反射光通过圆盘返回时,只有聚焦面发出的光才能通过这些孔。这些磁盘实际上是一个高速的光斩波器。正因为如此,旋转盘共焦在反射白光模式下工作得很好。它们通常用于半导体工业的晶片检测和牙科和材料研究。实时图像可以通过眼睛观看,并由数字或模拟相机记录存储。旋转盘共聚焦扫描速度比点扫描仪快得多(每秒360帧),但分辨率较低,不太适合荧光扫描。

纺丝盘共聚焦显微镜的最近进步取代了微透镜的孔。这大大提高了系统的敏感性,并提高了其对荧光标记样品的图像的能力。

在他的原始专利中,Minsky描述了透射光,阶段扫描共聚焦显微镜。通过针孔(A)所示的光通过冷凝器聚焦到样品(D)上的点。由物镜(O)收集来自焦点平面的光并通过PMT(P)检测的共聚焦针孔(B)。必须围绕由冷凝器透镜产生的光点扫描样品。如果样品没有刚性,这需要长时间扫描时间并且可能导致扭曲的图像。还有安全性和对准问题,因此这种设计并未被广泛追求。指向A,D和B对应于“共轭焦平面”,因此“共焦点”。

一种非常不同的共焦点设计最近越来越受欢迎。“数字反褶积”系统从传统的宽视场荧光显微镜上获取图像,并以数字方式去除失焦光。计算机有一张图,或“点扩散函数”,显示光如何通过一个特定的显微镜。该软件利用这张图来确定光源偏离焦点的是什么,并通过各种算法去除它。数字反褶积系统可以是廉价的,并改进现有的荧光显微镜。然而,图像容易产生伪影,不像现场扫描图像那样可靠。通常对传统的共焦图像进行反褶积,以进一步缩小“切片”。

常用的荧光探针

通常,可以在共聚焦上成像由可见光激发的任何荧光探针。然而,UV探针(例如DAPI,Hoechst,Fura-2)只能在Zeiss 710和Bio-rad Multiophoton系统上成像。对于大多数传统的UV激发探针,有可见光染料选项,可用于Zeiss 510s和Bio-rad 1024。

用于共轭的荧光探针

对抗体,生物素,strepavidin等

绿色荧光
FITC, Alexa 488, Cy2

Red Fluorescent
罗丹明,Cy3,德州红色,Alexa 568

远红色荧光
cy5,phycooerythrins.

DNA / RNA,核

绿色荧光
溜溜球,Sytox绿,放线菌素

Red Fluorescing
碘化丙啶,溴化乙锭

Far Red Fluorescing
TO-TO3, TOPRO

可行性染料

活细胞
钙黄绿素,CFDA
死细胞
Lodididifime
细胞凋亡的标签

细胞器探针

线粒体
水户跟踪器
Mito Fluor
Rhodamine-123.
DIC6.

膜标记

DiA,迪勒,戴奥
调频4 - 64
荧光凝集素

电解液/离子浓度

Ca + +
Fluo-3,钙绿,钙深红色
Mg + +
镁红,镁绿
ph
SNAFL,狼吞虎咽

荧光蛋白

GFP.
egfp.
CFP.
yfp.
招标书