酶细胞化学

Enzyme-Cytochemistry通过特定的底物反应识别组织或细胞类型内的酶,得到可见标记。

基质-酶作用的物质。

诱捕代理人-与底物结合,并包含可见的反应产物,如重金属或有色反应产物。

酶可以通过它们的示范方法进行分类。

A.同时捕获描述了培养介质中试剂与反应产物结合的方法。该技术的一个例子是碱性磷酸酶的双向方法。

B.孵育后偶联是基于不溶性反应产物的产生,该产物随后与有色或不透明物质偶联。Rutenburg和Seligman的酸性磷酸酶就是一个例子。

C.当水溶性染料因亲水性基团的去除而不溶解时,酶就会产生自色底物反应。然后在酶活性部位产生有色沉淀。

D.分子内重排产生着色的不溶性参与,在无色基质的酶活性位点。

酶促反应通常与免疫化学方法偶联。

免疫化学方法

免疫细胞化学或免疫组织化学是通过由可见标记标记的特异性抗原/抗体反应原位鉴定组织成分(蛋白质,脂多糖等)。免疫组织化学通常是指光水平检测和免疫细胞化学通常是指在EM分辨率下检测。

抗原是蛋白质或目标。抗体是免疫系统产生的一种结构,用来寻找并与特定的抗原结合。抗原由许多称为抗原表位的片段组成。抗原表位是与抗体结合的区域。

由于抗原和抗体之间的特殊关系,必须注意确保不通过其对应的识别而改变,同时保持抗原所在的组织或细胞的完整性。

抗体的结构

抗体的整体结构是Y形。组合(或反应性)位点位于两个臂的末端。这两端的结构从一个抗体变化到另一个抗体。第三区没有参与抗原结合。抗体的反应位点由含硫氨基酸之间的桥梁粘合的四个多肽链形成。一对相同的光链与一对重链有关。


图1:免疫球蛋白分子的示意图。

抗体结构是复杂的多链蛋白质,具有相同的整体形状,但每一个都有独特的区域,促进结合一个抗原而不是另一个。抗体链的折叠产生了符合抗原形状的裂口和中空,这样弱的分子间力就可以把抗原和抗体结合在一起。

抗体类型:

A.单烯烃是仅用于一个抗原位点的抗体。
多克隆是一种抗体的混合物,每一种抗体都针对同一抗原的特定表位。

免疫标签类型:

直接标记法只需要一个步骤,即特异性抗体直接复合体到可见标记物。


图2:直接标记的示意表示。

B.间接标记是一种两步方法,它使用针对抗原的抗体和偶联与可见标记的二抗。


图3:间接标记原理图。

C.多重标记(也称为双重或三重标记等)是指两个或多个不同抗体同时定位。显然,每种抗体必须使用不同的标记。

特定的标记:

A.荧光探针可用于在光水平下获得抗原定位。利用激光扫描共聚焦显微镜的发明,这种技术尤其强大,相对简单。
B.金颗粒是目前电子显微镜免疫染色中最流行的标签,在光照水平上使用频率也越来越高。这些粒子在电子显微镜下是离散的,不易弄错。它们有多种尺寸,可以贴双重标签。在光学显微镜下,必须使用银增强技术来显示。外偏振滤光片增强了对重金属标签的检测。
辣根过氧化物酶(HRP)是一种附着在免疫球蛋白上的酶标签,目的是利用酶的催化特性形成不溶性反应产物。
D.其他酶标记是碱性磷酸酶,β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化物。如HRP,这些酶需要色原(通常是二氨基苯甲酸二氨基苯胺,DAB或3-氨基-9-乙基咔唑,AEC)。

增强机制:

A.通过构建来自两种不同的抗体Fab部分的IgG分子,指向抗原的IgG分子和逆标签来实现杂种结合。



图4:抗体Fab和Fc片段可以被酶分离用于杂交结合或非常特异性的间接标记。

B.蛋白A或G可以标记在IgG的Fc(非反应部分)上,使两个反应位点可以自由地与抗原结合。


图5:蛋白质示意图。

C.当金颗粒太小而不能看到金颗粒,如在预防程序或光水平观察中,可以进行银增强。银将使金颗粒粘合。


图6:金的银色倾向。

D.酪酰胺信号放大

  • 增强信号1000 x
  • 易于纳入协议
  • 信噪比
  • 顺序多色检测
  • EM应用程序
  • Tyramide不能扩散
  • 可以与原位PCR一起使用或替代PCR


图7:酪胺信号放大示意图。

酶控制:

在可能的情况下,应同时采用阳性对照以证明试剂的活性。

B.通过浸入沸水15分钟,或通过用于证明酶的特定化学方法,可以通过破坏阳性对照中的酶活性来容易地进行阴性对照。

一个有用的控制方法是在没有底物的情况下将其中一个测试段孵育在反应混合物中,同时运行测试样品。这两个部分将一起完成该技术的其余部分。

免疫控制:

所有实验都应同时进行一系列的对照。在分析所有对照品之前,对任何“阳性”结果都应持怀疑态度。

一个。吸附。原发性抗体与过量的抗原反应。该控制表明,抗原而不是一些其他物质是对所见的定位负责。吸收的溶液不应与局部方案中的抗原反应。

B。标记或未标记抗体。这些分别用于代替共轭抗体。该控制确定标记抗体的特定性质是局部化的原因。

C。遗漏初级或二抗。如果在这些条件下看到标记,那么它就不是预期的抗体/抗原相互作用的结果。

D。使用免疫前血清。在使用原发性抗血清之前用于代替初级抗体的血清的集合将测试“阳性”如果除特异性IgG以外的免疫血清中的某些组分是负责的结合。通常不能从相同的动物获得免疫血清,但是可以从相同物种中使用正常的血清。

样本准备

对酶

大多数酶的活性要求组织尽可能保持新鲜。如果可以使用固定剂,应在冰箱中冷藏,以尽可能保持酶的活性。

不能存活固定的一些常见反应是酸和碱性磷酸酶和酯酶。酶在55摄氏度超过55摄氏度的温度下没有存活。

用于预先嵌入的免疫性Vs.嵌入后

A.预嵌入问题

1.固定前的细胞表面标记

一。冰冻切片
b。Vibratome部分

2.渗透可能是必要的,但通常导致不良的形态。

一种。冻结/解冻
湾洗涤剂(Saponin,Triton-X)
c。DMSO溶液

Pre-embedding Immunolabeling

1.所需时间 2 - 3天
2.切片 容易
标签 可能整个部分
4.序列部分 容易
5.存储 块和部分容易
6.设备 EM实验室常见
7.缺点 结构丧失,渗透化易位

B.包埋后免疫标记可以更好地控制形态

1.固定允许存储
2.嵌入媒体可能掩盖抗原
3.固定改变蛋白质结构

一种。可能需要蚀刻或脱屑
湾固定性免疫选择选择

固定的目标是稳定其原生位置的细胞组分。

1.化学固定将确保良好的形态,但可能会降低抗原性和/或酶活性

一种。点免疫反应测试可能有助于确定抗原性(附录B)
b.过度固定的组织可能对表位回收方法有反应(附录E)

2.物理固定可能会保持抗原完整性,但以牺牲形态为代价。对于许多酶促技术,可能需要冷冻标本。

一种。为了最大限度地减少冰晶损伤,使用了冷冻保护剂。

  • 蔗糖
  • DMSO
  • 甘油
  • 嵌入式媒体

C.其他优化反应的条件

  1. ph
  2. 抗体和/或底物的浓度
  3. 捕集剂浓度
  4. 温度(酶通常不会在55摄氏度超过55摄氏度上存活)
  5. 反应或注视时间

D.阻断试剂可用于阻断由于交叉反应性或多特异性引起的背景染色。

密切相关的抗原,其分子形状和电荷分布可以类似于原始抗原,并且可以适合相同的抗体。据说他们交叉反应。

图8:两种抗体与相关抗原反应(DNP)反应

已经知道非常不同的抗原也已知与单抗体结合,抗原边缘的密切触点和形成抗体的组合部位的壁的壁可能导致其束缚。此功能被称为多特异性。

图9:与两个非常不同的抗原(多特异性)反应的相同抗体。

开始免疫细胞化学项目的建议

附录