组织学

组织学的研究是为了了解细胞、组织和器官的微观解剖学,以及从结构的角度了解它们的功能。

固定

毫无疑问,观察生物组织最重要的一步是固定。固定的目的是使组织结构永久地保持在尽可能像生命一样的状态。

固定应在组织移除后尽快进行,或(如果可能)在体内进行,或在死亡后不久进行(在尸检的情况下)。根据组织的类型和要展示的特征,有多种固定剂可供使用。查阅文献,找出标本的最佳固定方法。

化学固定

一个。醛:醛通过交联蛋白质来修复样品,特别是在赖氨酸残基之间。

1.福尔马林是最常见的。标准溶液是10%的中性缓冲福尔马林。它不会对蛋白质的结构造成很大的损害,通常不会失去抗原性。

2.多甲甲醛福尔马林是福尔马林的一种更纯净的版本,经常作为一种优越的固定剂使用。穿透速度比福尔马林或戊二醛快。必须在使用前1周内制成粉末。

3.戊二醛引起α -螺旋结构的变形,所以通常不是免疫细胞化学的好选择。然而,固定是不可逆的,它提供了最好的细胞质和核细节。2.5%缓冲戊二醛是一种常见的电子显微镜固定剂。组织应小于1mm的立方,固定剂不超过3个月。

B。水银通过一个未知的机制来解决。它们含有氯化汞。渗透率相对较差并且导致组织硬度。它们提供了优异的核细节,最适用于血流和网状内皮组织。由于它们含有汞,必须仔细处理。

1.B-5固定剂汞色素和酸性甲醛血红蛋白是两种人工色素,在染色前必须去除。

2.Zenker的固定剂推荐用于淋巴结、脾脏、胸腺和骨髓。它能很好地固定原子核,给出很好的细节。在染色之前,水银必须被除去,否则会产生黑色的沉积物。

C。是蛋白质变性剂,并且不常规用于组织,因为它们导致硬度和脆性。酒精喷雾可用于通过医生造成血液涂片或PAP涂抹,但也可以使用廉价的发芽。

1.甲醇
2.乙醇

D。氧化剂交联蛋白质,但引起广泛的变性。

1.高锰酸钾
2.重铬酸钾
三氧化锇井固定脂肪和脂质,并赋予它们黑色着色。

E.苦味酸盐:未知的行动方法。产生良好的核细节,但硬度不如水银。

1.苦味酸爆炸性在它的干燥形式。当在解决方案时,它会污染黄色的一切。
2.Bouin的解决方案含有苦瓜。推荐用于睾丸,结缔组织,GI沟和内分泌组织。

影响固定的因素

缓冲溶液用来调节固定剂的pH值。最佳固定通常在中性pH(6-8)下进行。较低的pH值可以产生福尔马林-血红素色素,在组织中呈现为黑色的极化沉积物。

磷酸盐

2.碳酸氢盐

3. Cacodylate.

4.佛罗拿

渗透性取决于固定剂的扩散能力。最好的穿透剂是福尔马林和酒精。戊二醛是最糟糕的。任何固定剂在24小时内都不能穿透超过2-3毫米的实体组织或0.5厘米的多孔组织。

C.固定剂的体积是理想的固定剂与组织的比例为20:1。搅动和频繁变化的固定物有助于确保良好的固定。

D.温度的增加将增加固定速度。小心不要“煮”组织。热量将迅速凝结蛋白质,但也速度加速。

浓度应调整到尽可能低的水平。高浓度是昂贵的,并将引入类似于过度加热的人为因素。

F.组织去除和固定之间的时间间隔至关重要。更长的时间段将引入干燥伪影,丢失的细胞细胞器,核收缩和造成丛生丛生。大多数组织应保持在固定剂中24小时,然后储存在70%EtOH中。

身体固定

一个。快速冻结:最重要的是,组织快速冷冻,保持尽可能接近体内酶活性和抗原性。如果样品被冷冻太慢,则可以在冷冻过程中引入冻结伪影。冰晶形成尺寸和量与冷冻速度成正比。这些伪影可以在解冻时被视为孔,并且显得非常明显。

1.制冷剂:有许多冻结样品进行丧失低温的方法。通常将组织在低温恒温器本身中冻结。通常使用预冷却的异戊烷浴。对于被商业包埋化合物包围的冻结组织,优选直接浸入液氮中(LN2)。LN2约为-195摄氏度,如果将组织直接放入其中,则会导致气泡形成。如果没有通过包埋化合物包围,这种气体层会妨碍避免引起伪影。

2.冷冻保护剂:为了帮助保证冰晶不形成,有时会使用冷冻保护剂。一些常见的蔗糖,甘油和PVP是25-30%的蔗糖。

切割冷冻切片并不困难,但以下建议使产品更令人满意。

1.保持切片机清洁和润滑。
2.刀必须锋利,干净,无刻痕。
3.刀和卡盘必须安全而紧张。
4.清洁刀的中间部分。
5.温度必须适合您正在切割的组织类型。

防滚板是一个可摆动的塑料板,靠在刀上。它必须经过调整才能正常工作。盘子必须与刀口平行。在低温恒温器中,所有东西的温度都很重要。触摸刀,块,或防滚板会使它们温暖。如果防滚板不接触刀,它将轻微温暖,并导致部分粘住。

组织处理:一旦组织被固定,它必须被包围和基质浸润以增加切片的稳定性。

脱水:通常不能用大多数媒体渗透水溶液中的组织。必须通过一系列分级脱水剂(醇或丙酮)逐渐逐渐实现除水。通常使用50%70%95%的100%溶液。

在微观层面上,液/气界面之间的力量会造成足够的压力扭曲生物样品,因此在处理过程中让样品干燥不是一个好主意。

清算:脱水样品可以置于与嵌入介质混溶的非水液体中。

1.二甲苯是最常见的石蜡包埋清净剂。
2.甲苯对残余水的耐受性更强,但价格要贵3倍。
3.氯仿速度慢,而且危害健康。
4.水杨酸甲酯价格昂贵,但气味很好闻(也被称为鹿蹄草油)。
5.一些较新的二甲苯替代品是可用的,如果切片β -半乳糖苷酶(β -gal)染色组织必须。大多数都是以柠檬烯为基础的。柠檬烯是一种在柑橘皮中发现的挥发油(闻起来很香)。它们对健康的危害较小,而且工作良好,只要组织固定良好。

嵌入式媒体:为了非常薄地切割生物组织(以发送光子或电子通过),必须嵌入硬质物质中以供载体。样本需要较薄,嵌入介质必须越难。介质以液体形式渗透至良好的切片至关重要。有时可以施加真空用于困难的组织。

石蜡是最常见的媒体,可以在不同的熔点购买。
2.塑料也可用于更薄的部分或特殊染色。

microtomy.

包埋后,在切片机上将样品切成所需的厚度。对于光级观察,厚度通常为1-10微米。切片机最重要的特点是一把非常锋利的刀。

A.刀具可以由不同的材料制成,但通常您受到适配器的可用性的限制,以及您自己的小机油和嵌入式媒体的选择。

1.标准厚金属品种已经存在很长时间了。这些非常坚固,可以重新磨尖。它们是楔形的,价格在200美元左右。
2.薄款和一次性刀几乎是良好的,每次都放心一个好的优势,当刀中的缺口发生时,较少担心。它们每次花费约1美元,很容易处理。
3.玻璃刀可以用于塑料嵌入的组织切割更薄的切片。这种玻璃需要用特殊的机器切割。这是你能买到的最锋利的刀,但很易碎,不太耐用。

B.切割切片并不难。切好的部分有点棘手。重要的是要有适当的固定和嵌入组织或人工制品可以引入你的部分。

一些常见的伪影是:撕裂或撕裂组织,喋喋不休,孔,折叠和压缩。

石蜡切片法:在创建了一节的侧面之后,应在温水浴缸(45-55摄氏度)上布置在幻灯片上的那些,并拾取到幻灯片上。载玻片应在变暖托盘上保持平坦,直到载玻片和部分之间的所有水分消失。

对于后续的染色,最好使用高质量的玻片。在过去,像“subbing”幻灯片的追随者被使用。有些载玻片的表面是带离子电荷的。他们没有条纹,没有压力。大多数纸巾会一直粘到你擦干净为止。

塑料切片法:这通常用于较薄的部分和较高的分辨率。玻璃刀通常是在使用前制作的。有时还附加一个水槽来接住水箱。环氧树脂可以放在一滴水中,放在温暖的二甲苯环境中干燥。甲基丙烯酸酯是水溶性的,通常会在没有帮助的情况下在水中伸展。这些技术需要更多的切片技术。

参考文献

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