免疫化学

免疫化学方法

免疫细胞化学或免疫组织化学是通过由可见标记标记的特异性抗原/抗体反应原位鉴定组织成分(蛋白质,脂多糖等)。免疫组织化学通常是指光水平检测和免疫细胞化学通常是指在EM分辨率下检测。

抗原是蛋白质或目标。抗体是免疫系统产生的一种结构,用来寻找并与特定的抗原结合。抗原由许多称为抗原表位的片段组成。抗原表位是与抗体结合的区域。

由于抗原和抗体之间的特殊关系,必须小心谨慎,以确保两者都不会被对方改变而无法识别,同时保持抗原所在组织或细胞的完整性。

抗体的结构

抗体的整体结构是Y形。结合(或反应)位点位于两个臂的末端。这两端的结构因抗体的不同而不同。第三个区域不参与抗原结合。该抗体的反应位点是由四个多肽链通过含硫氨基酸之间的桥连接而形成的。一对相同的轻链与一对重链相连。


图1所示。免疫球蛋白分子原理图模型。

抗体结构是复杂的多链蛋白质,具有相同的整体形状,但每一个都有独特的区域,促进结合一个抗原而不是另一个。抗体链的折叠产生了符合抗原形状的裂口和中空,这样弱的分子间力就可以把抗原和抗体结合在一起。

抗体类型:

单克隆抗体是只针对一个抗原位点的特异性抗体。

B.多链物是抗体的混合物,每个对相同抗原的特定表位的特定表位。

免疫标记的类型:

直接标记法只需要一个步骤,即特异性抗体直接复合体到可见标记物。


图2。直接标记的示意图表示。

间接标记是一种两步法,使用抗体特异性抗原和二抗偶联到一个可见标记。


图3。间接标记示意图

C.多重标记(也称为双重或三重标记等)是指两个或多个不同抗体同时定位。显然,每种抗体必须使用不同的标记

特定的标记:

荧光探针可用于在光水平上获得抗原定位。随着激光扫描共聚焦显微镜的发明,这项技术特别强大,也相对简单。

B.金颗粒是目前电子显微镜免疫染色中最流行的标签,在光照水平上使用频率也越来越高。这些粒子在电子显微镜下是离散的,不易弄错。它们有多种尺寸,可以贴双重标签。在光学显微镜下,必须使用银增强技术来显示。外偏振滤光片增强了对重金属标签的检测。

辣根过氧化物酶(HRP)是一种附着在免疫球蛋白上的酶标签,目的是利用酶的催化特性形成不溶性反应产物。

D.其他酶标记是碱性磷酸酶,β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化物。如HRP,这些酶需要色原(通常是二氨基苯甲酸二氨基苯胺,DAB或3-氨基-9-乙基咔唑,AEC)。

增强机制:

A.杂交结合是通过构建两个不同抗体Fab段的IgG分子实现的,一个针对抗原,一个针对标签。


图4。该抗体的Fab和Fc片段可以被酶分离用于杂交结合或非常特异性的间接标记。

B.蛋白A或G可以标记在IgG的Fc(非反应部分)上,使两个反应位点可以自由地与抗原结合。


图5.蛋白是原理图。

C.当金颗粒太小而不能看到金颗粒,如在预防程序或光水平观察中,可以进行银增强。银将使金颗粒粘合。


图6。银增色金。

D.酪酰胺信号放大

  • 增强信号1000 x
  • 轻松纳入协议
  • 信噪比
  • 连续的多色探测
  • 他们的应用程序
  • Tyramide不能扩散
  • 可以与原位PCR一起使用或替代PCR


图7。酪胺信号放大示意图

酶控制

在可能的情况下,应同时采用阳性对照以证明试剂的活性。

B.阴性对照很容易通过在沸水中浸泡15分钟来破坏阳性对照中的酶活性,或者通过一种特定的化学方法来证明该酶。

一个有用的控制方法是在没有底物的情况下将其中一个测试段孵育在反应混合物中,同时运行测试样品。这两个部分将一起完成该技术的其余部分。

免疫控制

所有实验都应同时进行一系列的对照。在分析所有对照品之前,对任何“阳性”结果都应持怀疑态度。

答:吸附。一抗与过量的抗原反应。这一对照结果表明,所见的定位是抗原而不是其他物质造成的。在定位方案中,被吸收的溶液不应与抗原反应。

B.标记或未标记抗体。它们分别用于代替偶联抗体。这种对照决定了标记抗体的特定性质负责定位。

C.遗漏初级或二抗。如果在这些条件下看到标记,则由于抗体/抗原相互作用的结果,它不是标记。

D.使用预血清的使用。在使用原发性抗血清之前用于代替初级抗体的血清的集合将测试“阳性”如果除特异性IgG以外的免疫血清中的某些组分是负责的结合。通常不能从相同的动物获得免疫血清,但是可以从相同物种中使用正常的血清。

样本准备

对于酶

大多数酶活性需要组织尽可能清洁。固定剂,如果可以使用它们,应该是冰箱冷,以保持尽可能多的酶活性。

不能存活固定的一些常见反应是酸和碱性磷酸酶和酯酶。酶在55摄氏度超过55摄氏度的温度下没有存活。

用于预先嵌入的免疫性Vs.嵌入后

A.预嵌入程序

1.固定前的细胞表面标记

一。冰冻切片
b。Vibratome部分

2.渗透可能需要渗透性,但通常导致形态差。

一种。冻结/解冻
湾洗涤剂(Saponin,Triton-X)
c。DMSO溶液

预嵌入免疫标签

1.所需时间 2 - 3天
2.切片 容易
标签 可能在切片
4.序列部分 容易
5.存储 块和部分容易
6.设备 EM实验室常见
7.缺点 结构丧失,渗透化易位

B.嵌入后免疫标签可以控制形态的控制

1.固定允许存储
2.嵌入媒体可能掩盖抗原
3.固定改变蛋白质结构

蚀刻或揭膜可能是必要的
湾固定性免疫选择选择

固定的目标是稳定其原生位置的细胞组分。

1.化学固定将确保良好的形态,但可能会降低抗原性和/或酶活性

点免疫反应试验可能有助于确定抗原性。(附录B)
湾过混合的组织可以响应表位检索方法。(附录e)

2.物理固定可以保持抗原的完整性,但以牺牲形态为代价。对于许多酶促技术,冷冻标本可能是必要的。

a.为了减少冰晶损伤,使用了低温保护剂。

  • 蔗糖
  • DMSO溶液
  • 甘油
  • 埋置媒体

C.优化反应的其他条件

1.pH值
2.抗体和/或底物的浓度
3.捕集剂浓度。
4.温度(酶通常不能在超过55摄氏度的温度下存活)。
5.反应或固定时间。

由于交叉反应性或多特异性,可以使用阻断试剂阻断背景染色。

紧密相关的抗原,其分子形状和电荷分布可能与原抗原相似,并可能适合同一抗体。它们被称为交叉反应。


图8。两个抗体与一个相关抗原(DNP)发生交叉反应。

已经知道非常不同的抗原也已知与单抗体结合,抗原边缘的密切触点和形成抗体的组合部位的壁的壁的壁可能导致它变得束缚。此功能被称为多特异性。


图9.与两个非常不同的抗原(多特异性)反应的相同抗体。

启动免疫细胞化学项目的建议

明确抗体的来源和质量。研究抗原的特性。* * *检查文献。* * *

1.抗体质量

一种。多克隆或单克隆?
b.如果多克隆?
c。特异性测试?
d.用哪种动物饲养?

2.描述了抗原

细胞内的还是细胞外的?
湾哪些物种产生蛋白质?
C。尺寸?

B.从免疫荧光开始。

1.检查自发荧光的样品
常见的荧光染料

一。Fluorescein-isothiocyaniate (FITC)
湾四甲基溴胺(Tritc)

3.在冷冻或轻质多聚甲醛固定样品上测试该方法。

C.用免疫氧化酶或免疫氧化酶或免疫酸酶或免疫蛋白质的光水平测试EM固件。

1.常用的方法

过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)
湾抗霉素 - 生物素复合物(ABC)

2.各种固定液

一。戊二醛
湾多甲甲醛
c。戊二醛/多聚甲醛
d。Periodate-lysine-paraformaldehyde (PLP)

3.反应产物在LM和EM均可见。

D.必要时选择EM协议(见附录D)


附录A:自发荧光

问题组织:

  • 上皮(Stratum Corneum&腺)
  • 白细胞(中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)
  • 心肌纤维
  • 神经组织

原因:

  • 内源性酶
  • 双成键
  • 醛固定
  • 年龄

固定剂:

1.甲醇,1%酸性酸和1%Na硝基氰化物
2.0.05%苯肼
3.H 2 O2
4.0.074% HCl in absolute ETOH (0.2 ml/100ml)

自发荧光的淬火程序:

1.甲醛蒸气(60°C - 80°C)
2.羊毛铬黑
3.亚硝酸钠
4.1:5或1:20 IgG抗血清
5. Playase.
6.胰蛋白酶
7.胃蛋白酶(4mg / ml在0.01N HCl @ 37°C〜20-30分钟)
8. Mayer的血毒素占有
9.Pontamine天蓝色


附录B:点印迹试验

1.硝化棉纸被切成窄条。用镊子夹纸。

2.通过温和搅拌在蒸馏水中洗涤纸张5分钟。

3.在室温下干燥。

4.稀释的溶液或盐水中的抗原悬浮液点缀在过滤器上。使用~ 20 ul。

  • 复合抗原可用0.1-1.0mg/ml。
  • 可以相应地稀释较少的复杂抗原。
  • 核酸结合需要在80℃下烘烤60分钟。

5.彻底干燥。在此阶段可存放数周。

6.用1%正常血清中的3%牛血清白蛋白(BSA)在TBS中轻轻搅动15分钟。

7.与测试抗体在室温下孵育2-4小时,或过夜。

8.用TBS洗30分钟(换几次)。

9.重复阻挡步骤。

10.用靶向试验抗体的辣根过氧化物酶 - 缀合的次级抗体孵育过滤器2小时。浓度可能会有所不同,但封闭溶液中的1/1000左右。

11.在TBS中洗涤30分钟(几种变化)。

12.用4-氯-1-萘酚和过氧化氢进行。

13.在2-15分钟内,阳性反应结果在白色背景上的蓝色斑点。

该测试可用于确定实际免疫抑制在实验样品的实际免疫培养前的最佳浓度和固定剂。

开发解决方案:

甲醇中3mg / ml氯萘。股票溶液可在寒冷中保持在黑暗中,持续1-2周。当出现泛黄的迹象时丢弃。在使用前用5体积TB和0.01%过氧化氢稀释。


附录C:冷冻切片免疫荧光染色的样品方案

1.切割8-10毫米的部分,并放置在一个超级霜冻加充电幻灯片。让玻片达到室温并干燥。*

2.将载玻片置于含有10%正常血清的PBS (pH 7.4)溶液中(用于制备二抗的动物),阻断非特异性蛋白。在室温下放置30分钟。

3.用1%胎牛血清用PBS(pH7.4)稀释的一抗体的放置。**该步骤可以在室温下或在4°C下过夜进行1小时。

4.在每次3分钟的3分钟内洗涤良好,每次(如果可能的话)。

5.用1%胎牛血清用PBS (pH 7.4)稀释二抗(抗动物抗体或抗一抗并与荧光探针偶联)。在溶液中浸泡30分钟。

6.在每次3分钟的3分钟内洗涤良好(如果可能的话)。

7.安装Vecta屏蔽安装介质。用指甲油密封边缘。如果将无法立即查看幻灯片,请储存在潮湿,黑暗和凉爽的环境中长达一周。

*这是允许样品干燥的唯一时间。在第二步之后,它们必须保持潮湿,或可能会导致误报。

**必须通过为每个稀释因子运行一系列稀释因子来确定伯次和二抗稀释。即使抗体已经在另一个实验室中测试过抗体也是如此。以下图表可能会有所帮助。

幻灯片#一次稀释二次稀释特异染色量(++,+,-)

1/100 1/100.
B 1/100 1/500.
C 1/100 1/1000
D 1/100无二次
E 1/500 1/100.
F 1/500 1/500
g 1/500 1/1000
H /500无二次
我1/1000 1/100
J 1/1000 1/500.
K 1/1000 1/1000
l 1/1000没有次要
M没有1/100
N没有主的1/500
o没有小学1/1000
P没有主要没有次要


附录D:EM-IMMunogold折叠污染的标准孵化时间表

准备孵化缓冲区:

PBS (10mM磷酸盐缓冲液,150mm NaCl), pH 7.4

0.5%牛血清白蛋白,0.1%明胶,20mm NAN3。检查pH值并根据需要调整到7.4。

1.用PBS的0.05m甘氨酸或赖氨酸孵育。
15分钟

2.嵌段在5%正常的血清中(与二级相同的物种)。
30分钟

3.一抗稀释液(1-5ug/ml)孵育缓冲液。或者在4摄氏度下过夜
30min-1小时

4.孵化缓冲
6 x 5分钟。

5.免疫轭缀合物的稀释(1/75-1 / 150)
2小时

6.孵化缓冲
6 x 5分钟。

7.美国公共电视台
3 x 5分钟。

8.后固定在2.5%戊二醛中
5分钟

9. PBS.
5分钟

10.ddH2O
5 x 2分钟。

11.像往常一样对比染色

所有解决方案都作为液滴放置在清洁的parafilm表面上。将栅格放置在液滴顶部,以孵化时间。

不是使用铜网格。镍网格是首选,因为它们不会与金胶体反应。


附录E:表位检索

A.热诱导表位检索(HIER)

缓冲

  • 1mM EDTA pH 8.0
  • 0.01M柠檬酸缓冲液,pH 6.0
  • TRIS-HC.
  • 尿素
  • 重金属溶液(锌、铅)
  • 其他公司产品

用高压锅、蒸锅、热板、水合高压釜或微波炉加热溶液至沸腾。将切片放入溶液中,继续加热10-30分钟。

B.酶表位检索

用于此目的的常用酶

  • 胰蛋白酶
  • 胃蛋白酶
  • 链霉蛋白酶
  • 蛋白激酶*
  • Ficin.
  • Dnase

c .超声波

d .甲酸