光学显微镜

介绍

光学显微镜在许多研究实验室中发挥着重要作用,包括电子显微镜设施。它们可用作主要可视化工具或支持电子显微镜。用于光学显微镜的样品以越来越多的技术制备,并且可以从切片生物生物和组织培养物到材料科学和地质样品。光线和电子显微镜在光学原理中分享了许多相似之处。了解光学显微镜的作用是如何对于获得最佳光图像至关重要,而且是为了理解电子显微镜。

光、电子和显微学原理

在显微镜中,我们利用光的波形特性。这些波在一个特定的源产生时,会以与传播线成直角的角度振动。每一波都有波峰和波谷。光线向前移动的距离是一个波长()波长随光源的颜色和强度而变化。


图1: 波浪的示意图。

图像是如何形成的

调用光学显微镜的结构仅对它们发射的光产生小的影响。改变的是瞬间振动的阶段。传统的BrightField照明将缺乏对比度,并且样本的细节仍然是看不见的。当新出现的波由于折射率变化而获得的较大相位差时,产生更大的对比度。这通过边缘效应(衍射,折射和反射)来表现出来。示例详细信息可以以多种方式解决。当光通过染色的结构时,根据光被吸收,根据样品的颜色和密度,选择性地减小。白光波长的选择性吸收产生彩色光。折射改变光线的方向,因为它从一个媒体传递到另一个媒体。波长越短,折射角度越大。 Diffraction is the bending of light rays around objects with sharp edges. A new wave front is created at this edge. Diffraction can be useful, but can also reduce resolution. When light is dispersed it is separated into its constituent wavelengths as a result of refraction on entering a transparent medium. Contrast can be defined as a steep slope between bright and dark image points. Adequate contrast MUST be achieved before the specimen can be resolved.

两种通常混淆的术语,但显微镜是焦度的倍数和分辨率。放大率是图像中的尺寸的程度,或者看起来相对于对象中的对应尺寸而放大。分辨率是在图像中显示细节的动作或结果。没有分辨率的放大率会毫无意义。

光学显微镜的理论分辨率首先由阿贝定义如下式。

光学显微镜理论分辨的Abbe方程:

光学显微镜所能达到的实际分辨率并没有那么高。我们将在后面讨论其原因。

重要的是要理解和识别光学显微镜的各种组成部分。第一个也许是最重要的元素是镜片。


图2: 六个简单的镜头。A,B,&C是会聚或正透镜。D,E,&F是凹形或负镜头。


图3: 会聚和发散镜头。平行光线进入凸透镜融合并以原则焦点相遇。镜头中心与主要焦点之间的距离是焦距。平行光线进入凹形镜头偏离,永不满足。

物镜是成像系统的第一部分;物镜形成物体的一个原始的、放大的图像。用物镜来区分非常精细的细节。目镜有时被称为晶状体,是第二个晶状体,它形成第二个,进一步放大的图像。将物镜的放大率与目镜的放大率相乘,得到最终的放大率。次级聚光镜是第三个光学组件。它被放置在物体下面的平台上。光线被引导通过次级冷凝器,并在样品的位置上汇聚到一点。光线在通过标本时发散,形成一个倒立的锥形,其底座大到足以填满物镜的孔径。光束的大小是由聚光器下面的光圈控制的,光圈叫做光圈。

光源应包含镜头来投影称为场冷凝器的灯丝的图像和隔膜,以控制被称为现场隔膜的照明场的尺寸。


图4: 光学显微镜用的典型灯。

科勒照明是最常见的照明方法。在Kohler照明中,源的图像由场冷凝器投射到物体平面的顶部。该方法可确保甚至照明。

现代光学显微镜根据研究者的需要使用几种不同的操作模式。其中最常见的是亮场显微镜,在这种显微镜中,直射光通过物镜的光圈,照亮所看到的图像的背景。由于被分解的结构元素折射率变化很小,图像将缺乏对比度,细节仍然不可见。通过染色方法改变物体的吸收,可以揭示微小的结构细节。

许多显微镜都有特殊的透镜,可以让研究者利用相衬成像。这种方法揭示了在光路或周围介质折射率有细微差异的标本的细节。相位对比不需要染色,可以用于活组织。在这种方法中,通过光线的相位差使物体在图像上的振幅差产生对比度。相位板改变了衍射光所经过的光程长度,而不是直接光所经过的光程长度。


图5: 通过一个物体后明亮的菲尔德和相位对比度的光波。路径A代表灯具之前遇到对象。波B表示在BrightField(未染色模式)中通过后的波相。C将对象的波段与相位对比度进行比较。

差分干扰对比度(DIC)与相位对比度不同,因为图像具有强烈的浮雕和三维外观。必须记住,表面细节的印象是光学器件的结果,而不是大多数生物样品的标本。DIC的光学器件由光源和冷凝器中的硅棱镜的光学器组成,并在电容器上方的上述偏振器组成。光束通过偏振器,进入其在两个中分开的第一棱镜。一个光束振动与棱镜平行,一个是垂直的。两个光束在紧密接近的平行上通过样品并在第二棱镜中重新组合。


图6: 差分干扰对比示意图。

暗场显微镜是一种阻止直射光通过物镜孔径的模式,但一个中空的光锥在样品的平面上形成一个顶点。图像是由物体的特征散射光形成的。细节在黑暗的背景下呈现明亮的白色。暗场也可以用于活的细菌、藻类和浮游生物。

一些材料在通过短波长的辐射激发时产生光。这种效果称为荧光或自动荧光。不荧光物体的样品可以用产生二次荧光的荧光铬处理。通过用高强度汞或氙源照射并过滤除了所需的激励波长以接触样品,从而产生的较长(较少的能量)波长从其自我偏振的样本的排放。荧光显微镜可用于增强特定的细胞器,免疫细胞化学,原位杂交,酶细胞化学和元素定位。


图7: 荧光显微镜。


图8: 干燥物镜和油浸物镜的比较。

阿贝为了便于识别透镜质量,设计了一个数值孔径方程。数值孔径数可以帮助比较干燥、水浸和油浸物镜的角度。注意理论分辨率与阿贝方程的相似性。所有物镜上都有这个数字。

n。a。= n sin u
n =介质的折射率
U = 1/2在聚焦物体上拍摄的光线角度。

选择目标时,另一个考虑因素是景深。景深是从最近部分的距离在可接受的重点中可接受的焦点到最远的焦点。透镜的效率(分辨率)与场景深成反比(表1)。

附加说明 .25 .30 .50 .65 .85 .95
深度(微米) 8.0 5.5 2.0 1.0 .25 .10

表1:NA.变化变化的景深变化。

镜片中的两种像差会减损来自Abbe的理论分辨率方程。这些像差称为球面像差和色差。当进入透镜的外光线与在中心附近的进入的那些不同地衍射时,发生球面像差。用于减少球面像差的溶液正在引入隔膜或孔径。


图9: 一个简单镜头的球面像差。答:纠正。B.过度纠正。

应根据特定目标的规格选择盖玻片的厚度。偏离所需的厚度导致过度校正或校正球面像差。

当白光进入透镜被分解成从红色到紫色的光谱时,就会发生色差。紫色光线(能量更高)比红色光线(能量更低)折射更多。因此,未经矫正的透镜周围会有彩色条纹。更贵的镜片矫正度更高。


图10: 简单镜头的色差。每个光谱颜色都有一个单独的焦点。

定义

阿贝的公式 -光学显微镜的理论分辨率。

吸收 -根据它通过的介质的颜色和密度,选择性地减小。

Brightfield显微镜 -光直接通过样品并通常需要染色。

色差,由通过透镜的不同能量的光波引起的。

冷凝器镜头 -将光束聚焦到样本上

对比- - - - - -白色和黑色之间的斜坡。更多坡度,更加对比。

融合镜头 -折射光线到透镜另一侧焦点的折射

Darkfield显微镜 -防止直接光穿过样品,但是允许光的中空锥体在标本平面中形成一个顶点,导致暗背景中的明亮样品。

景深,在可接受的焦点的样本上最远到最远的点之间的距离。

差动干扰对比度 -在未染色的样本中提供最令人缓解的操作模式。

衍射,在物体周围弯曲光线。

分散,光波分界将光分成其组成波长

发散镜头 -通过透镜从镜片的同一侧的焦点向外折射作为照明光。

荧光显微镜 -样品被短波长的辐射激发时产生光。

场aperature -在聚光透镜附近放置的可调节的光圈,以帮助光线直接照射到标本上。

科勒照明 -用于优化样本的均衡的对准机制。

放大,相对于对象中的相应尺寸,图像中的尺寸的程度是或看起来的程度。

物镜-用于图像放大的主透镜。

相态显微镜 -通过改变光路中的波长相位来揭示样品中的细节。

解析度-在图像中显示细节的动作或结果。

折射-光线方向的变化从一个媒体传递到另一个媒体。

球面像差,进入透镜的外部光线的折射与通过透镜中心的光线的折射不同。

波长,光从峰到峰或从槽到槽所经过的距离。