X射线微基分析


理论

电子束/标本交互

在电子显微镜中进行电子束激发的固体样本表现出与主光束电子的复杂相互作用。这些相互作用导致可以在显微镜中检测的各种信号。为了在视觉上分析样本,可以选择通过收集和显示SE,BSE或透射电子来观看样本的图像。要确定有关组合的信息,可以选择录制X射线或螺旋钻孔电子。

1.二次电子

二次电子是通过与光束电子的相互作用喷射的标本电子。它们用于成像,因为它们的空间分辨率高和地形敏感性。他们携带有关元素组成的很少信息。它们通常具有小于50ev的能量。

2.背散射电子

背散射电子(BSE’s)是与样品原子的原子核相互作用的束流电子,具有弹性散射,能量损失很小。疯牛病来自于样本深处所以它们的空间分辨率较低。它们提供元素信息,因为产生的疯牛病的数量与样品中元素的原子序数成正比。

3.x射线连续(轫致辐射)

光束电子可以由原子核的库仑场散射,从而放出其一些能量。这种能量以X射线辐射的形式发出,称为Bremsstrahlung(用于“制动辐射”的德语)。光束电子可以放弃任何量的能量,因此发射的X射线的能量分布是连续的光束能量。X射线信号的该组件称为连续体。

4.特征x射线

特征X射线由标本的价壳中的电子束位移产生。当电子移位时,来自更高价壳的电子必须填充其轨道。结果是X射线光子形式的少量能量损失。损失量损失的含量是独特的,原子是发射的原子。X射线在标本内深处生产,因此空间分辨率非常差。

5.螺旋钻电子

有时,产生特征X射线,然后在相同的原子内重新吸收,喷射较低的能量电子。这是一个螺旋钻电子。螺旋钻电子拥有精确的能量,该能量与原始特征X射线的能量与喷射电子的粘合能的能量完全等于差异。他们携带有关它们起源的原子的特定化学信息。它们具有非常低的能量(几个EV'),因此携带有关样本表面的信息(前几个原子层)。


命名法

这些线通常根据壳体命名,其中发生初始空位,并且从该外壳中填充空位的外壳。

例如:如果初始空位发生在K层,而填补空位的电子从邻近的壳层(L壳层)掉落,就会发射出Ka x射线。我们最关心的是K系列、L系列和m系列的x射线,因此它们被称为KLM线。


显微镜

1.扫描电子显微镜

一种。SEM中的电子产品制作了一个小探头,但稳定性通常很差
b. SEM适用于各种附件
C。样品准备是最小的
d.可提供1-30 kV加速电压
e。分辨率约为20-100Å

2.微探针

A.它可能有也可能没有高空间成像
B.立柱配置为高强度、稳定探头
C。它通常配备有多个波长光谱仪。
天。它适用于非常准确的定量分析
e。加速5-30 kV的电压是典型的。

3.扫描透射电子显微镜

一种。高分辨率是可能的
湾使用电子衍射成像的相位识别
c.非常小区域的EDS分析
天。75-300 kV的电压是可能的
标本体积小,标本准备困难
F。操作员也可以访问所有SEM信号


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1.波长分散光谱(WDS)

一小部分离开样品的x射线撞击晶体,然后反射到探测器上。这种晶体只能反射波长范围很窄的x射线,因此布拉格定律可以用于测定元素含量。

由于特定晶体仅衍射仅是X射线的非常窄波长,因此一个晶体可用于检测几个原子数。石膏晶体将检测原子编号元件11至14,钠晶将拾取原子编号元件16至37。

当聚焦的x射线穿过一扇薄薄的塑料窗,进入一个充满气体的圆柱体,圆柱体里有一根保持高正电压的集电极线时,就可以检测到它们。x射线引起氩气-甲烷气体的电离,并产生流向导线的电子。电流随时间被测量和量化。电流的大小与原始x射线的能量直接相关,因此可以确定x射线是从哪个元素发射出来的。

2.能量分散光谱(EDS)

A.探测器

在EDS中,检测器通常由单晶晶2-3mm厚。选择晶体的纯度和形状,但即使是这样,电导率也很大变化,有必要将锂漂移到晶体中以填充任何空的格子空间。

该晶体中的原子共价键合。每个X射线在该价带中产生光电子。形成电子孔对的传导频带耗散能量。每个电子孔对产生3.8-3.9 eV。每个X射线都会产生约1,000个孔对。由电荷产生的电流与吸收的X射线的能量成比例。由于电子的随机激发和低温温度有助于控制这一点,可以存在残留的电导率。

由于它们极度敏感性,必须保护探测器免受柱内部的影响。大多数标准探测器使用铍窗口来实现此目的。较低的能量X射线(比钠轻的东西)不会通过这个窗口。

在晶体旁边是一种薄的金层,有助于传导。在此之后,一个空格被称为死层,其中由于不完整的锂漂移而出现孔。这里发生一些吸收,在光谱峰上导致“尾”。

当x射线进入探测器时,会发生很多事情。它甚至可能无法接触到水晶,因为窗户、金层或死层可能会吸收它。它可能能量太大,通过晶体时没有相互作用。或者,x射线和晶体中硅原子之间的相互作用可能是这样的,硅原子产生自己的x射线,x射线从探测器中逃逸出来,被弹回柱中。最后一种情况导致了逃逸峰的形成。逃逸峰的形成取决于入射探测器的角度和母峰的能量。逸出的结果是一个比母峰低1.47 keV的人为小峰。

B.前置放大器或场效应晶体管

在晶体中收集后,该信号在此直接出血。从脉冲中减去偏置电压。脉冲光学反馈用于减少电子噪声,结果是“死区时间”,其中系统不能在处理信号时采用任何数据。

C.脉冲处理器/放大器

来自前置放大器的脉冲成形和放大用于模拟转换。必须分离这些脉冲,因为脉冲的高度携带关于X射线的能量的信息。脉冲堆抑制器可以拒绝一起进入系统的脉冲。

D.模拟到数字转换器和多通道分析仪。

将脉冲从模拟信号转换为数字信号,然后根据高度将其分成不同的通道。多通道分析仪组装光谱,并让您通过键盘控制它。


优点和缺点

WDS优势

1.高分辨率,X射线线的分离
2.量化-甚至对微量元素也有好处
3.良好的峰值与背景比率
4.轻质元件易于检测
5.不需要液氮

WDS缺点

1.机械部件会移动,除非适当调整和校准,否则容易出现误差。
2.每次只分析一种元素
3.来自高阶衍射线的可能干扰
4.峰值和背景必须分开测量

eds优势

1.不需要x射线聚焦。
2.高灵敏度 - 高实角度
3.没有衍射干扰
4.简单的机械设计,无移动部件,容易添加到显微镜
5.与计算机兼容的输出
6.高计数率愉悦性,允许更小的探头直径(更少的样品损坏
7.整个元素谱显示,快速定性分析

EDS缺点

1. LN2的恒定供应(每周填充3倍)
2.梁必须稳定
3.与晶体光谱仪相比的劣质性分辨率
4.高背景噪声引起的X射线源
5.量化 - 浓度非常低的准确性


生物学应用

x射线微量分析可用于生物样品的检测。应用,如:

1.分析细胞电解质(扩散离子)
2.识别细胞和组织中的内源性和外源性物质
3.细胞表面标记
4.检查无色组织化学反应产物
5.分析组织化学反应的中间阶段
6.研究超微结构的组织化学
7.分析体液的微滴

生物x射线分析通常在透射电镜下对厚度为50 ~ 100 nm的薄膜标本进行。在形态和离子在其原始位置的维持和位置之间有一个权衡。


问题

1.K线重叠

锇,铀和铅L和M线可以重叠k线的感兴趣元素。这增加了背景并降低了该技术的灵敏度,尤其是在寻找跟踪元素时。

元素 起源 干扰峰值 峰重叠
K. 在标本中自然发生 Kß. 卡卡
PB. 弄脏 m S ka,cl ka
弄脏 m K Ka
OS. 固定剂 m p ka,s ka,cl ka
Au. 网格 m p ka,s ka
作为 缓冲 L. na ka,mg ka
AG 沉淀剂 L. cl ka,k ka
网格,显微镜柱 L. 娜卡
网格 L. 娜卡

2.厚度

薄片质量较低,因此计数率较低。

3.大众损失

生物标本中的低原子元素很容易损失质量。

4.离子迁移率

正常的生物样品制备方案从原始位点分散或渗出离子。这在脱水步骤中最大地发生。受影响最大的元素是钠,磷,钾,硫和氯。


解决方案

解决对生物组织进行x射线显微分析的问题在于所采用的标本制备技术。

1.冷冻干燥

将新鲜组织立即放入低温元中,例如:丙烷(最常见),氟利昂,丁烷,乙烷或异戊烷。然后将其转移到液氮中并在10-3-10-5托的真空下在-50℃下置于冷冻干燥单元约2天。然后将真空缓慢降低,温度缓慢升高至室温。然后,如果在TEM中观察或安装在SEM的碳短管上,则可以用树脂渗透组织。组织未用化学品加工,结果将在TEM中具有低对比度。如果需要,组织可以用乙醇酸铀酰染色。当切片时,乙二醇用作船流体,因为感兴趣的组分是水溶性的。

2.冻结替换

新鲜组织的冷冻方式与冷冻干燥相同。然后将组织浸入无水乙醚或其他中间溶剂中,在-90°C下浸泡几天。温度慢慢升高,同时组织被树脂渗透。

3. CryoultramicOrotomy.

将一小块新鲜组织放置在金属销的末端并迅速在液氮中冷冻。在玻璃刀上切割薄部分,安装在Formvar涂覆的网格上并冷冻干燥。

4.空气干燥

该技术用于小细胞,如精子,细菌和真菌。

5.细胞化学技术

化学品如聚酰氨酸钾(KSB(OH)6)与锇氧化物固定剂和灌注到组织中。没有使用醛。聚锑酸盐与特定阳离子(最典型的钙和锌)反应,在这些位点处析出锑。在以下处理步骤中除去阳离子,但锑仍然存在。这不是定量技术,反应强烈依赖于缓冲液,渗透性,固定类型,洗涤程序,染色程序等中的pH,PO4离子。


显微镜参数的考虑

大量损失
质量损失是通过梁(辐照损伤)的样本变薄。

2.充电
电荷的积聚会导致离子从原来的位置迁移。

3.热搭建
由于非弹性散射事件,热量在标本中积聚。

4.污染
电子束将沉积在样品上的碳氢化合物分子聚合起来。


显微镜参数的选择

1.加速电压
对于X射线分析,较高的加速电压更好。使用较低的加速电压导致更多的充电,更多的热堆积和更多污染。较高的加速电压也能提供更好的分辨率,即使会有更多的质量损失和更低的对比度。在网格栏附近的成像可以帮助消散充电问题,而是将增加网格材料释放的X射线。

2.倾斜
倾斜的样品将增加对比和帮助克服质量损失提供一个更长的路径,电子束通过的样品。

3.电子束电流
需要对样本的充足电流密度获得足够的计数速率,但应使用最低可能的梁电流来防止对样本的光束损坏。通过调节光斑尺寸,亮度,冷凝器Aperature和偏置来控制梁电流。(偏差调整应为最后一个案例方案)。

4.使用冷阶段
控制试样中的热积聚以降低质量损失和离子迁移。